實(shí)驗(yàn)原理

    蛋白質(zhì)分子中所含和殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有zui大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。此法的缺點(diǎn)是：（）對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中和含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測(cè)定蛋白范圍應(yīng)在0.~.0mg /mL。ELISA試劑盒

試劑和器材

一、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液

    結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成mg/mL蛋白溶液。

2. 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

    人血清，使用前稀釋00倍。ELISA試劑盒

二、器材

    試管.5×5cm（×9），試管架，移液管mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度計(jì)。

操作方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取8支試管編號(hào)，按下表分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、樣品測(cè)定

    取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液mL，加入蒸餾水3mL，搖勻，按上述方法在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

注意事項(xiàng)

    由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的和苯，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時(shí)也會(huì)影響紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。ELISA試劑盒