谷研試劑-常用蛋白質(zhì)與非蛋白含氮化合物檢測(cè)項(xiàng)目（一）

一、體液總蛋白

體液總蛋白包括數(shù)量眾多的各種蛋白質(zhì)，在進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)作了如下假定：①所有蛋白質(zhì)都是單純的多肽鏈，糖脂類和金屬有機(jī)物等均不計(jì)在內(nèi)，其含氮量平均為6％；②各種蛋白質(zhì)理化性質(zhì)雖不同，但與化學(xué)試劑的反應(yīng)性一致。顯然，這過于理想化，因此任何一種化學(xué)方法測(cè)定體液總蛋白，均存在一定的缺陷。測(cè)定蛋白質(zhì)一般利用蛋白質(zhì)*的結(jié)構(gòu)或

性質(zhì)：①重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)；②分子中均含有氮原子；③與色素結(jié)合的能力；④沉淀后借濁度或光折射測(cè)定；⑤和殘基對(duì)酚試劑反應(yīng)或被紫外光吸收。臨床實(shí)驗(yàn)室利用以上原理測(cè)定體液蛋白質(zhì)的方法有多種，各種方法性能和應(yīng)用情況不同，zui常用的是雙縮脲法，以下將重點(diǎn)介紹。

(一)雙縮脲法

【檢測(cè)原理】蛋白質(zhì)中的兩個(gè)相鄰肽鍵(一CO—NH一)在堿性溶液中能與二價(jià)銅離子(Cu。’)作用產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)與雙縮脲(H：N—Oc—NH—CO—NH：，為兩個(gè)尿素分子縮合而成)在堿性溶液中與Cu。’作用形成紫紅色的反應(yīng)相似，因此，將蛋白質(zhì)與堿性銅反應(yīng)的方法稱為雙縮脲法(biuret，．method)。

【參考區(qū)間】血漿總蛋白隨年齡增大有所增高，60歲后則稍有下降。新生兒為46～70g／L，數(shù)月齡到2歲為5～75g／L，3歲及以上為60~80g／L，成人為64～83g／L(直立行走)和60~78g／L(臥床)。

【臨床意義】血漿總蛋白濃度下降常由白蛋白濃度下降引起；濃度增高主要見于慢性炎癥等多克隆免疫球蛋白增多，以及漿細(xì)胞病的單克隆免疫球蛋白增多癥。

【評(píng)價(jià)】

·特異性 因至少含兩個(gè)…CO NH 基團(tuán)才能與Cu。’絡(luò)合，故氨基酸及二肽無反應(yīng)，三肽以上才能反應(yīng)。體液小分子肽含量極低，對(duì)蛋白質(zhì)來說可忽略不計(jì)。

2·呈色一致性 因呈色強(qiáng)度與肽鍵數(shù)量即蛋白質(zhì)含量成正比，因此各種蛋白質(zhì)呈色強(qiáng)度基本相同，在目前所有總蛋白測(cè)定方法中。

3·臨床應(yīng)用 本法檢測(cè)范圍為0～20g／L，靈敏度不高，但很適合血清總蛋白濃度測(cè)定，絕大多數(shù)正常和病理血清總蛋白均在其檢測(cè)范圍內(nèi)。雙縮脲法測(cè)定胸腹水總蛋白的檢測(cè)低限為0．47g／L，生物檢測(cè)限為．33g／L，胸腹腔積液總蛋白多數(shù)在4．5～50g／L，因此能采用該法測(cè)定。對(duì)蛋白質(zhì)濃度很低的腦脊液和尿液，該法不是合適的定量方法。

(二)測(cè)定體液總蛋白的其他方法

·染料結(jié)合法在酸性環(huán)境下，蛋白質(zhì)帶正電荷，可與染料陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生顏色改變，常用染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)、鄰苯三酚紅鉬等。前兩種常作為血白蛋白電泳的染料。考馬斯亮藍(lán)常用于需更高呈色靈敏度的蛋白電泳中，也可用于尿液、腦脊液等樣品的蛋白質(zhì)定量測(cè)定，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、靈敏，但比色杯對(duì)染料有吸附作用，在自動(dòng)生化分析儀中無法很好地清洗(手工清洗常采用乙醇)。染料結(jié)合法均存在不同蛋白質(zhì)與染料結(jié)合力不一致的問題。

目前臨床上zui常用的是鄰苯三酚紅鉬(pyrogallol red molybdate，PRM)法。其原理是：在酸性介質(zhì)中，鄰苯三酚紅一鉬酸鹽與樣品中的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使其zui大吸收峰從467nm轉(zhuǎn)移至594nm，在600nto處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法靈敏度高，檢測(cè)F限為lO~20mg／L，多數(shù)試劑盒的檢測(cè)上限約為2g／L。試劑不吸附比色杯，可用于自動(dòng)生化分析儀中。不足之處仍然是試劑與各種蛋白質(zhì)的呈色

2·凱氏定氮法(Kjeldahl method)該法于883年建立，是經(jīng)典的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。其原理是：測(cè)定樣品中的含氮量，推算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中含氮量較為恒定，平均6％，即lg氮相當(dāng)于6．25g蛋白質(zhì)。含氮化合物用硫酸加熱分解，在有催化劑存在的條件下，生成硫酸銨，后者再與濃堿作用生成NH。OH，采用蒸餾法將氨蒸餾并被硼酸吸收，將硼酸銨用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的消耗量可算出總氮量，再折算成蛋白質(zhì)含量。該法定量準(zhǔn)確性好，精密度高，靈敏度高，并適用于任何形態(tài)的樣品測(cè)定，至今仍被認(rèn)為是測(cè)定許多生物樣品中蛋白質(zhì)含量的參考方法。但該法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不適合臨床常規(guī)測(cè)定。樣品中各種蛋白質(zhì)含氮量有少許差異，尤其在疾病狀態(tài)下差異可能更大。對(duì)于非蛋白含氮化合物較高的血清樣品，則還要測(cè)定無蛋白血濾液中非蛋白氮含量并將其扣除。

3·比濁法(turbidimetry) 某些酸如三氯乙酸、磺基水楊酸等能與蛋白質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生微細(xì)沉淀，由此產(chǎn)生的懸浮液濁度大小與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用于測(cè)定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)濃度較低的樣品；缺點(diǎn)是影響濁度大小的因素較多，包括加入試劑的手法、混勻技術(shù)、反應(yīng)溫度等，且各種蛋白質(zhì)形成的濁度亦有較大的差別。目前臨床上較多應(yīng)用的是芐乙氯銨法，其原理是：芐乙氯銨在堿性條件下與蛋白質(zhì)形成沉淀，其懸浮液穩(wěn)定，可在660nm處進(jìn)行濁度測(cè)定。該法是比濁法中較好的方法，其靈敏度、準(zhǔn)確度以及對(duì)白蛋白和球蛋白的反應(yīng)一致性都優(yōu)于其他比濁法，檢測(cè)范圍較廣，可用于自動(dòng)化分析，然而其精密度仍不夠理想。

4．酚試劑法(phenol reagent method) 由Folin于92年*，早期用于和測(cè)定，后由吳憲開始用于蛋白質(zhì)定量。酚試劑法的原理是運(yùn)用蛋白質(zhì)中和使磷鎢酸和磷鉬酸還原為鎢藍(lán)和鉬藍(lán)。該法靈敏度較高。Lowry將酚試劑法進(jìn)行了改良，先用堿性銅溶液與蛋白質(zhì)反應(yīng)，再將銅．肽鍵絡(luò)合物中的和與酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生zui大吸收在745～750nm的顏色，使呈色靈敏度更為提高，達(dá)到雙縮脲法的00倍左右，有利于檢出較微量的蛋白質(zhì)。各種蛋白質(zhì)中和的含量不同，如白蛋白含0．2％，而球蛋白含2％～3％，因此本法不適合測(cè)定混合蛋白質(zhì)，只適合測(cè)定單一蛋白質(zhì)，如測(cè)定組織中某一蛋白質(zhì)抽提物。該法易受還原性化合物的干擾，如帶一SH的化合物、糖類、酚類等。

5．直接紫外吸收法根據(jù)蛋白質(zhì)分子在280nm或25／225nm的紫外吸光度值計(jì)算蛋白質(zhì)含量。其原理是：芳香族氨基酸在280nm處有一吸收峰，可用于蛋白質(zhì)的測(cè)定。因生物樣品常混有核酸，核酸zui大吸收峰為260nm，在280nm也有較強(qiáng)的光吸收，因而測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度可采用兩個(gè)波長(zhǎng)的吸光度予以校正，即蛋白質(zhì)濃度(g／I。)：．4：80nto。一0．74A：60nm。該法準(zhǔn)確性受蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸的含量影響甚大，而且尿酸和在280nm附近有干擾，所以不適合血清、尿液等組成復(fù)雜的體液蛋白質(zhì)測(cè)定，常用于較純的酶、免疫球蛋白等測(cè)定。本法不加任何試劑且不需要處理，可保留制劑的生物活性，可回收全部蛋白質(zhì)。