植物RNAout
產(chǎn)品及特點(diǎn) 本產(chǎn)品是天澤基因自主開(kāi)發(fā)的*產(chǎn)品，其原理*不同于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了后者不能區(qū)分RNA （本質(zhì)上是多糖）和其他植物多糖的缺點(diǎn)，能將RNA和其他植物多糖分開(kāi)，同時(shí)還能有效去除多酚和其他植物次級(jí)代謝成份。其有效性在近五十多種各類植物（見(jiàn)附錄，包括十分棘手的松柏類植物）中得到驗(yàn)證。
. 適用于絕大多數(shù)植物，從五十多種植物材料中都成功提取到了總RNA，其中包括松針、柏樹(shù)、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物組織，如果實(shí)， RNase含量*, 需要另外加RVC抑制其活性）。
2. 操作簡(jiǎn)單快速，zui短可以只需要約十五分鐘，可以全在室溫下進(jìn)行。
3. 得到的RNA平均 OD260/280在.9左右，可直接用于RT-PCR和Northern等研究。
規(guī)格及成分 成份 50 次包裝 250 次包裝
溶液A 50 mL 250 mL
溶液B 5 mL 75 mL
溶液C 25 mL 25 mL
溶液D 25 mL 25 mL
使用手冊(cè) 份 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。
自備試劑 氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。
使用方法 . 準(zhǔn)備
a） 估算試劑和組織細(xì)胞的用量并準(zhǔn)備足夠的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液 （如RNASAVER、無(wú)RNase的水或有滅活殘留RNase活性的液相RNase清除劑）。每次微量提取一般需要00-200 mg植物葉片、或50-00 mg植物種子、或200-500 mg植物果實(shí)。
b） 溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前必須放在65℃水浴使沉淀*溶解。
2、 勻漿
a） 先將新鮮植物切成小塊（保存在RNALOCKER中的植物組織需用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊），放入0-5 mL塑料離心管中，加入 mL溶液A，然后用勻漿器勻漿5-20秒，將不超過(guò) mL的勻漿液轉(zhuǎn)移至干凈的.5 mL塑料離心管中（可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片）。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。有的植物組織（果實(shí)）含有大量水份，勻漿液會(huì)多于 mL，轉(zhuǎn)移時(shí)也只取 mL。
b） 如果用硯磨法破碎植物組織，需將植物組織浸泡在 mL溶液A中再硯磨，盡量避免植物組織跟空氣直接接觸，然后將硯磨物轉(zhuǎn)移到新的.5 mL離心管中。
3、 *次分相
a） 在裝有裂解物的離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。
b） 室溫2000-5000 g離心5分鐘，兩相間將有約5-0毫米厚的細(xì)胞破碎物。
c） 將上清液（約0.8 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的.5 mL塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。留下00 uL上清液不取。
4、 第二次分相
a） 在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。
b） 室溫2000-5000 g離心3分鐘，兩相間將有白色膜狀物（蛋白質(zhì)）形成。
c） 將上清液（約 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的.5 mL塑料離心管中,避免觸及或吸取有機(jī)相及其上面的白色膜狀物。
5、 沉淀
a） 在上清液中加入0.5倍體積的溶液D，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈白色渾濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。如果提取 50 mg以下的微量植物組織樣品，在此步加入天澤基因的微量助沉劑RNADOWN。
b） 室溫2000-5000 g離心3-5分鐘，RNA將在管底形成白色沉淀（約黃豆大小）。如果組織樣品量少或需要提高RNA回收率，也可以延長(zhǎng)離心時(shí)間到20-30分鐘。
c） 小心移棄上清液，避免觸及管底R(shí)NA沉淀。
注意：如果加入溶液D離心后沉淀漂浮在上面，說(shuō)明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物樣品，也可以適當(dāng)加無(wú)RNase的水稀釋直到沉淀能夠沉下去為止。如果離心后管底有類似氯仿的相出現(xiàn)，說(shuō)明上一步離心時(shí)間不夠或取上清時(shí)取到了下層的有機(jī)相，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或取上清時(shí)留下約00 uL不取或在第四步時(shí)加0.3 mL的自備氯仿。
6、 *次清洗
a） 在離心管中加入mL 75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。
b） 室溫2000-5000 g離心分鐘，RNA將在管底形成細(xì)小沉淀（約芝麻大小）。
c） 小心吸棄上清液,注意不要吸棄RNA沉淀。
7、 第二次清洗
a） 重復(fù)第六步一次。
b） 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液,注意不要吸棄沉淀。此步將有效去除殘留的乙醇，否則后續(xù)反應(yīng)會(huì)受到影響。
8、 溶解
a） 加入適量（一般為20-00 μL） RNA溶解液使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千萬(wàn)不要用真空離心法使RNA沉淀過(guò)于干燥,否則RNA將變得十分難溶。
9、 檢測(cè)
a） RNA完整性的電泳檢測(cè)
如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：44，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用TAE或天澤基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快速電泳液，但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒(méi)經(jīng)過(guò)去RNase處理，所以不要使用。
尤其需要注意的是不要使用TBE進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)門(mén)BE所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過(guò)與RNA核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合復(fù)合物，使同樣長(zhǎng)度的RNA具有不同的泳動(dòng)速度，電泳條帶彌散，同時(shí)有大的RNA絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會(huì)誤以為是基因組DNA污染）。RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數(shù)量比例有關(guān)，而RNA樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會(huì)參與此反應(yīng)，使硼酸對(duì)RNA電泳的影響更復(fù)雜，所以TBE對(duì)RNA電泳的影響沒(méi)有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。
由于動(dòng)物細(xì)胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S （約4800 nt），8S （約900 nt）和5.8S （約20 nt）三種組成，所以變性膠電泳后應(yīng)該在UV下看見(jiàn)三條清晰的rRNA帶。由于核酸長(zhǎng)度與結(jié)合EB的數(shù)量成正比（當(dāng)然還與RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，雙鏈部分結(jié)合能力比單鏈部分強(qiáng)），所以28S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比8S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng).5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因?yàn)榇蟮腞NA被酶降解的可能更大）。
跟動(dòng)物一樣，植物果實(shí)和種子的RNA一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA有四條或更多rRNA帶，多余的RNA來(lái)源于葉片中大量存在的葉綠體。
b） RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定
將5-0 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH7.5-8.2之間）檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過(guò)光吸收可以得出RNA濃度（ OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積）和產(chǎn)率（RNA產(chǎn)量/組織用量）。
注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測(cè)OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測(cè)得的低0%-5%，因?yàn)楹怂峁馕崭芤簆H相關(guān)，而DEPC水中的DEPC高壓分解后產(chǎn)生的CO2 與水反應(yīng)生成碳酸，使溶液pH降低進(jìn)而降低RNA的光吸收。RNA的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同，00 mg種子的RNA產(chǎn)量一般為00-20 μg，00 mg葉片為30-60 μg, 00 mg果實(shí)為20-40 μg。
c） RNA純度測(cè)定
無(wú)污染的總RNA的OD260/OD280一般在.8-2.之間（具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)），OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用天澤基因的DNA Erasol 和PS Erasol去除。